GB 5009.158-2016食品安全国家标准
食品中维生素K1的测定
前言
本标准代替GB/T5009.158-2003《蔬菜中维生素K1的测定》和GB5413.10-2010《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素K1的测定》。
本标准与GB/T5009.158-2003相比，主要变化如下：
——标准名称修改为“食品安全国家标准食品中维生素K1的测定"；
——增加了高效液相色谱-荧光检测法；
——增加了液相色谱-串联质谱法；
——删除了高效液相色谱-紫外检测法。
1范围
本标准规定了食品中维生素K1的测定方法。
本标准第一法为高效液相色谱-荧光检测法，第二法为液相色谱-串联质谱法，均适用于各类配方食品、植物油、水果和蔬菜中维生素K1的测定。
第一法高效液相色谱-荧光检测法
2原理
婴幼儿食品和乳品、植物油等样品经脂肪酶和淀粉酶酶解，正己烷提取样品中的维生素K1后，用C18液相色谱柱将维生素K1与其他杂质分离，锌柱柱后还原，荧光检测器检测，外标法定量。水果、蔬菜等低脂性植物样品，用异丙醇和正己烷提取其中的维生素K1，经中性氧化铝柱净化，去除叶绿素等干扰物质。用C18液相色谱柱将维生素K1与其他杂质分离，锌柱柱后还原，荧光检测器检测，外标法定量。
3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。
3.1试剂
3.1.1无水乙醇（CH3CH2OH）。
3.1.2碳酸钾（K2CO3）。
3.1.3无水硫酸钠（Na2SO4）。
3.1.4异丙醇（C3H8O）。
3.1.5正己烷（C6H14）。
3.1.6甲醇（CH3OH）：色谱纯。
3.1.7四氢呋喃（C4H8O）：色谱纯。
3.1.8乙酸乙酯（C4H8O2）。
3.1.9冰乙酸（CH3COOH）：色谱纯。
3.1.10氯化锌（ZnCl2）：色谱纯。
3.1.11无水乙酸钠（CH3COONa）。
3.1.12氢氧化钾（KOH）。
3.1.13脂肪酶：酶活力≥700U/mg。
3.1.14淀粉酶：酶活力≥1.5U/mg。
3.1.15锌粉：粒径50μm~70μm。
3.2试剂配制
3.2.1 40%氢氧化钾溶液：称取20g氢氧化钾于100mL烧杯中，用20mL水溶解，冷却后，加水至50mL，储存于聚乙烯瓶中。
3.2.2磷酸盐缓冲液（pH8.0）：溶解54.0g磷酸二氢钾于300mL水中，用40%氢氧化钾溶液调节pH至8.0，加水至500mL。
3.2.3正己烷-乙酸乙酯混合液（90+10）：量取90mL正己烷，加入10mL乙酸乙酯，混匀。
3.2.4流动相：量取甲醇900mL，四氢呋喃100mL，冰乙酸0.3mL，混匀后，加入氯化锌1.5g，无水乙酸钠0.5g，超声溶解后，用0.22μm有机系滤膜过滤。
3.3标准品
维生素K1（C31H46O2，CAS号：84-80-0）：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.4标准溶液配制
3.4.1维生素K1标准贮备溶液（1mg/mL）：准确称取50mg（精确至0.1mg）维生素K1标准品于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。将溶液转移至棕色玻璃容器中，在-20℃下避光保存，保存期2个月。标准储备液在使用前需要进行浓度校正，校正方法参照附录A。
3.4.2维生素K1标准中间液（100μg/mL）：准确吸取标准贮备溶液10.00mL于100mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。将溶液转移至棕色玻璃容器中，在-20℃下避光保存，保存期2个月。
3.4.3维生素K1标准使用液（1.00μg/mL）：准确吸取标准中间液1.00mL于100mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。
3.4.4标准系列工作溶液：分别准确吸取维生素K1标准使用液0.10mL、0.20mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，维生素K1标准系列工作溶液浓度分别为10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL。
3.5材料
3.5.1中性氧化铝：粒径50μm~150μm。
3.5.2中性氧化铝柱：2g/6mL，填料中含10%水，可直接购买商品柱，也可自行装填。
注：中性氧化铝柱装填方法：
a）填料处理：取200g中性氧化铝于500mL的广口瓶中，于150℃干燥箱中烘烤2h，加盖后于干燥器中冷却至室温，缓慢加入20mL纯水，边加边摇，加完后加上瓶盖，放入80℃烘箱中3min~5min，取出后，剧烈振摇，直至瓶内氧化铝自由流动，无结块，置于干燥器中冷却30min，备用。
b）层析柱装填：取6mL的针筒式柱套，加入筛板，称取2.00g上述经脱活化处理的填料，再加入一块筛板，用装填工具压紧。
3.5.3锌柱：柱长50mm，内径4.6mm，锌柱可直接购买商品柱，也可自行装填。
注：
a）锌柱填装方法：将锌粉密集装入不锈钢材质的柱套（柱长50mm，内径4.6mm）中。装柱时，应连续少量多次将锌粉装入柱中，边装边轻轻拍打，以使装入的锌粉紧密。
b）锌柱接入仪器前，须将液相色谱仪所用管路中的水排干。
3.5.4微孔滤头：带0.22μm有机系微孔滤膜。
4仪器和设备
4.1高效液相色谱仪：带荧光检测器。
4.2匀浆机。
4.3高速粉碎机。
4.4组织捣碎机。
4.5涡旋振荡器。
4.6恒温水浴振荡器。
4.7 pH计：精度0.01。
4.8天平：感量为1mg和0.1mg。
4.9离心机：转速≥6000r/min。
4.10旋转蒸发仪。
4.11氮吹仪。
4.12超声波振荡器。
5分析步骤
5.1试样制备
米粉、奶粉等粉状样品经混匀后，直接取样；片状、颗粒状样品，经样本粉碎机磨成粉，储存于样品袋中备用；液态乳、植物油等液态样品摇匀后，直接取样；水果、蔬菜等取可食部分，水洗干净，用纱布擦去表面水分，经匀浆器匀浆，储存于样品瓶中备用。制样后，需尽快测定。
5.2试样处理
警示：处理过程应避免紫外光直接照射，尽可能避光操作。
5.2.1婴幼儿食品和乳品、植物油
5.2.1.1酶解
准确称取经均质的试样1g~5g（精确到0.01g，维生素K1含量不低于0.05μg）于50mL离心管中，加入5mL温水溶解（液体样品直接吸取5mL，植物油不需加水稀释），加入磷酸盐缓冲液（pH8.0）5mL，混匀，加入0.2g脂肪酶和0.2g淀粉酶（不含淀粉的样品可以不加淀粉酶），加盖，涡旋2min~3min，混匀后，置于37℃±2℃恒温水浴振荡器中振荡2h以上，使其充分酶解。
5.2.1.2提取
取出酶解好的试样，分别加入10mL乙醇及1g碳酸钾，混匀后加入10mL正己烷和10mL水，涡旋或振荡提取10min，6000r/min离心5min，或将酶解液转移至150mL的分液漏斗中萃取提取，静置分层（如发生乳化现象，可适当增加正己烷或水的加入量，以排除乳化现象），转移上清液至100mL旋蒸瓶中，向下层液再加入10mL正己烷，重复操作1次，合并上清液至上述旋蒸瓶中。
5.2.1.3浓缩
将上述正己烷提取液旋蒸至干（如有残液，可用氮气轻吹至干），用甲醇转移并定容至5mL容量瓶中，摇匀，0.22μm滤膜过滤，滤液待进样。
不加试样，按同一操作方法做空白试验。
5.2.2水果、蔬菜样品
5.2.2.1提取
准确称取1g~5g（精确到0.01g，维生素K1含量不低于0.05μg）经均质匀浆的样品于50mL离心管中，加入5 mL异丙醇，涡旋1 min，超声5 min，再加入10 mL正己烷，涡旋振荡提取3 min，6000r/min离心5min，移取上清液于25mL棕色容量瓶中，向下层溶液中加入10mL正己烷，重复提取1次，合并上清液于上述容量瓶中，正己烷定容至刻度，用移液管准确分取上清液1mL~5mL（视样品中维生素K1含量而定）至10mL试管中，氮气轻吹至干，加入1mL正己烷溶解，待净化。
5.2.2.2净化、浓缩
将上述1mL提取液用少量正己烷转移至预先用5mL正己烷活化的中性氧化铝柱中，待提取液流至近干时，5mL正己烷淋洗，6mL正己烷-乙酸乙酯混合液洗脱至10mL试管中，氮气吹干后，用甲醇定容至5mL，过0.22μm滤膜，滤液供分析测定。
不加试样，按同一操作方法做空白试验。
5.3色谱参考条件
a）色谱柱：C18柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm，或具同等性能的色谱柱；
c）流动相：按3.2.4配制；
d）流速：1mL/min；
e）检测波长：激发波长为243nm，发射波长为430nm；
f）进样量：10μL；
g）标准溶液的色谱图见附录B。
5.4标准曲线的制作
采用外标标准曲线法进行定量。将维生素K1标准系列工作液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以峰面积为纵坐标，以标准系列工作液浓度为横坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程。
5.5试样溶液的测定
在相同色谱条件下，将制备的空白溶液和试样溶液分别进样，进行高效液相色谱分析。以保留时间定性，峰面积外标法定量，根据线性回归方程计算出试样溶液中维生素K1的浓度。
6分析结果的表述
试样中维生素K1的含量按式（1）计算：
式中：
X——试样中维生素K1的含量，单位为微克每百克（μg/100g）；
ρ——由标准曲线得到的试样溶液中维生素K1的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
V1——提取液总体积，单位为毫升（mL）；
V3——定容液的体积，单位为毫升（mL）；
100——将结果单位由微克每克换算为微克每百克样品中含量的换算系数；
m——试样的称样量，单位为克（g）；
V2——分取的提取液体积（婴幼儿食品和乳品、植物油V1=V2），单位为毫升（mL）；
1000——将浓度单位由ng/mL换算为μg/mL的换算系数。
计算结果保留三位有效数字。
7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
8其他
婴幼儿食品和乳品、植物油，当取样量为1g，定容5 mL时，检出限为1.5μg/100g，定量限为5μg/100g；果蔬样品当取样量为5g，提取液分取5mL，定容5mL时，检出限为1.5μg/100g，定量限为5μg/100g。
第二法液相色谱-串联质谱法
9原理
婴幼儿食品和乳品、植物油等样品经脂肪酶和淀粉酶酶解，用正己烷提取样品中的维生素K1后，用C18液相色谱柱将维生素K1与其他杂质分离，串联质谱检测，同位素内标法定量。
水果、蔬菜等低脂性植物样品，用异丙醇和正己烷提取其中的维生素K1，经中性氧化铝柱净化，去除叶绿素等干扰物质。用C18液相色谱柱将维生素K1与其他杂质分离，串联质谱检测，同位素内标法定量。
10试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。
10.1试剂
10.1.1无水乙醇（CH3CH2OH）。
10.1.2碳酸钾（K2CO3）。
10.1.3氢氧化钾（KOH）。
10.1.4甲酸（HCOOH）：色谱纯。
10.1.5甲酸铵（HCOONH4）：色谱纯。
10.1.6异丙醇[（CH3）2CHOH]。
10.1.7正己烷[CH3（CH2）4CH3]。
10.1.8甲醇（CH3OH）：色谱纯。
10.1.9乙酸乙酯（C4H8O2）。
10.1.10脂肪酶：酶活力≥700U/mg。
10.1.11淀粉酶：酶活力≥1.5U/mg。
10.2试剂配制
10.2.1 40%氢氧化钾溶液：称取20g氢氧化钾于100mL烧杯中，用20mL水溶解，冷却后，加水至50mL，储存于聚乙烯瓶中。
10.2.2磷酸盐缓冲液（pH8.0）：溶解54.0g磷酸二氢钾于300mL水中，用40%氢氧化钾溶液调节pH至8.0，加水至500mL。
10.2.3正己烷-乙酸乙酯混合液（90+10）：量取90mL正己烷，加入10mL乙酸乙酯，混匀。
10.2.4流动相：1000mL甲醇中加入0.25mL甲酸和0.1575g甲酸铵，超声溶解后，用0.22μm有机系滤膜过滤。
10.3标准品
10.3.1维生素K1（C31H46O2，CAS号：84-80-0）：纯度≥99.3%。
10.3.2维生素K1-D7（C31H46O2，CAS号：1233937-39-7）：纯度≥99.5%。
10.4标准溶液配制
10.4.1维生素K1标准贮备溶液（1mg/mL）：准确称取50mg（精确至0.1mg）维生素K1标准品于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。将溶液转移至棕色玻璃容器中，在-20℃下避光保存，保存期2个月。标准储备液在使用前需要进行浓度校正，校正方法参照附录A。
10.4.2维生素K1标准中间液（100μg/mL）：准确吸取维生素K1标准贮备溶液10.00mL于100mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。将溶液转移至棕色玻璃容器中，在-20℃下避光保存，保存期2个月。
10.4.3维生素K1标准使用液（1μg/mL）：准确吸取维生素K1标准中间液1.00mL于100mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。
10.4.4维生素K1-D7同位素内标贮备溶液（100μg/mL）：准确称取1mg（精确至0.01mg）维生素K1-D7同位素内标，用甲醇溶解并定容至10mL。
10.4.5维生素K1-D7同位素内标使用液（1μg/mL）：吸取维生素K1-D7同位素内标贮备溶液1.00mL于100mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。
10.4.6标准系列工作溶液：分别准确吸取维生素K1标准使用液0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、
1.00mL、2.00mL、4.00mL于10mL容量瓶中，各加入同位素内标使用液0.50mL，加甲醇定容至刻度，此标准系列工作液维生素K1浓度分别为10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、
200ng/mL、400ng/mL。
10.5材料
10.5.1中性氧化铝：粒径50μm~150μm。
10.5.2中性氧化铝柱：2g/6mL，填料中含10%水，可直接购买商品柱，也可自行装填。
注：中性氧化铝柱装填方法：
a）填料处理：取200g中性氧化铝于500mL的广口瓶中，于150℃干燥箱中烘烤2h，加盖后于干燥器中冷却至室温，缓慢加入20mL纯水，边加边摇，加完后加上瓶盖，放入80℃烘箱中3min~5min，取出后，剧烈振摇，直至瓶内氧化铝自由流动，无结块，置于干燥器中冷却30min，备用。
b）层析柱装填：取6mL的针筒式柱套，加入筛板，称取2.00g上述经脱活化处理的填料，再加入一块筛板，用装填工具压紧。
10.5.3微孔滤头：带0.22μm微孔滤膜。
11仪器和设备
11.1液相色谱-质谱联用仪：带电喷雾离子源（ESI）。
11.2匀浆机。
11.3高速粉碎机。
11.4组织捣碎机。
11.5涡旋振荡器。
11.6恒温水浴振荡器。
11.7 pH计：精度0.01。
11.8天平：感量1mg和0.1mg。
11.9离心机：转速≥6000r/min。
11.10旋转蒸发仪。
11.11氮吹仪。
11.12超声波振荡器。
12分析步骤
12.1试样制备
米粉、奶粉等粉状样品经混匀后，直接取样；片状、颗粒状样品，经样本粉碎机磨成粉，储存于样品袋中备用；液态乳、植物油等液态样品摇匀后，直接取样；水果、蔬菜等取可食部分，水洗干净，用纱布擦去表面水分，经匀浆器匀浆，储存于样品瓶中备用。制样后，需尽快测定。
12.2试样处理
警示：处理过程应避免紫外光照，尽可能避光操作。
12.2.1婴幼儿食品和乳品、植物油
12.2.1.1酶解
准确称取经均质的试样1g~5g（精确到0.01g，维生素K1含量不低于0.02μg）于50mL离心管中，加入同位素内标使用液（1μg/mL）0.25mL，加入5mL温水溶解（液体样品直接吸取5mL，植物油不需加水稀释），加入磷酸盐缓冲液（pH8.0）5mL，混匀，加入0.2g脂肪酶和0.2g淀粉酶（不含淀粉的样品可以不加淀粉酶），加盖，涡旋2min~3min，混匀后，置于37℃±2℃恒温水浴振荡器中振荡2h以上，使其充分酶解。
12.2.1.2提取
取出酶解好的试样，分别加入10mL乙醇及1g碳酸钾，混匀后加入10mL正己烷，涡旋提取10min，6000r/min离心3min，转移上清液至另一50mL离心管中，向下层液再加入10mL正己烷，涡旋5min，6000r/min离心3min，合并上清液，正己烷定容至25mL，待净化。
12.2.1.3净化
在上述提取液中加入20mL水，振摇0.5min，静置分层后，分取5mL上清液于10mL的玻璃试管中，氮吹至干，加入1mL甲醇溶解，用0.22μm滤膜过滤，滤液待进样。
不加试样，按同一操作方法做空白试验。
12.2.2水果、蔬菜样品
12.2.2.1提取
准确称取1g~5g（精确到0.01g，维生素K1含量不低于0.02μg）经均质匀浆的样品于50mL离心管中，加入同位素内标使用液（1μg/mL）0.25mL，加入5mL异丙醇，涡旋1min，超声5min，加入10mL正己烷，涡旋振荡提取3min，6000r/min离心5min，移取上清液于25mL棕色容量瓶中，向下层溶液中再加入10mL正己烷，重复提取1次，合并上清液于上述容量瓶中，正己烷定容至刻度，用移液管准确分取上清液5mL至10mL试管中，氮气轻吹至干，加入1mL正己烷溶解，待净化。
12.2.2.2净化
将上述1mL提取液用少量正己烷转移至预先用5mL正己烷活化的中性氧化铝柱中，待提取液流至近干时，5mL正己烷淋洗，6mL正己烷-乙酸乙酯混合液洗脱至10mL试管中，氮气吹干后加入1mL甲醇，过0.22μm滤膜，滤液供分析测定。
不加试样，按同一操作方法做空白试验。
12.3色谱参考条件
a）色谱柱：C18柱，柱长50mm，内径2.1mm，粒径1.8μm，或具同等性能的色谱柱；
b）流动相：甲醇（含0.025%甲酸+2.5mmol/L甲酸铵）；
c）流速：0.3mL/min；
d）柱温：30℃；
e）进样量：5μL。
12.4质谱参考条件
a）电离方式：ESI+；
b）鞘气温度：375℃；
c）鞘气流速：12L/min；
d）喷嘴电压：500V；
e）雾化器压力：172kPa；
f）毛细管电压：4500V；
g）干燥气温度：325℃；
h）干燥气流速：10L/min；
i）多反应监测（MRM）模式。
锥孔电压和碰撞能量见表1，质谱图见附录C。
12.5标准曲线的制作
将标准系列工作溶液按浓度由低到高注入液相色谱-质谱仪进行测定，测得相应色谱峰的峰面积，以标准系列工作溶液中维生素K1的浓度为横坐标，维生素K1的色谱峰的峰面积与同位素内标色谱峰的峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线。
12.6试样溶液的测定
将试样溶液注入液相色谱-质谱仪进行测定，测得相应色谱峰的峰面积，根据标准曲线得到试样溶液中维生素K1的浓度。如试样溶液中维生素K1的浓度超出线性范围，则需适当减少取样量按12.2处理试样后重新测定。
12.7定性
试样中目标化合物色谱峰的保留时间与标准色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在±2.5%之内。
待测化合物定性离子色谱峰的信噪比应≥3，定量离子色谱峰的信噪比应≥10。
每种化合物的质谱定性离子应出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表2规定的范围。
13分析结果的表述
试样中维生素K1的含量按式（2）计算：
式中：
X——试样中维生素K1的含量，单位为微克每百克（μg/100g）；
ρ——由标准曲线得到的试样溶液中维生素K1的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
V1——提取液总体积，单位为毫升（mL）；
V3——定容液的体积，单位为毫升（mL）；
100——将结果单位由μg/g换算为μg/100g样品中含量的换算系数；
m——试样的称样量，单位为克（g）；
V2——分取的提取液体积，单位为毫升（mL）；
1000——将浓度单位由ng/mL换算为μg/mL的换算系数。
计算结果保留三位有效数字。
14精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
15其他
婴幼儿食品和乳品、植物油，当取样量为1g，提取液分取5mL，浓缩后定容1mL时，检出限为
1.5μg/100g，定量限为5μg/100g；果蔬样品当取样量为5g，提取液分取5mL，浓缩后定容1mL时，检出限为0.3μg/100g，定量限为1μg/100g。
