中华人民共和国国家标准
GB 5009.273-2016
食品安全国家标准
水产品中微囊藻毒素的测定
前言
本标准代替SN/T2678-2010《进出口淡水产品中微囊藻毒素的检测方法酶联免疫吸附法》。
本标准与SN/T2678-2010相比,主要变化如下:
——标准名称修改为“食品安全国家标准水产品中微囊藻毒素的测定”;
——增加了液相色谱-串联质谱法。
1范围
本标准规定了水产品中微囊藻毒素(环状七肽)的液相色谱-串联质谱和间接竞争酶联免疫吸附的测定方法。
本标准适用于鱼、虾、河蚌等水产品中微囊藻毒素的测定。
第一法液相色谱-串联质谱法
2原理
试样中的微囊藻毒素(MC-LR,MC-RR和MC-YR)经甲醇溶液提取,固相萃取小柱净化,液相色
谱-串联质谱测定,外标法定量。
3试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。
3.1试剂
3.1.1甲醇(CH4O):色谱纯。
3.1.2甲酸(CH2O2):色谱纯。
3.1.3甲酸铵(CH5O2N):色谱纯。
3.1.4乙腈(C2H3N):色谱纯。
3.1.5氮气:纯度≥99.99%。
3.2试剂配制
3.2.1甲醇溶液(20%):将20mL甲醇与80mL水混合均匀。
3.2.2甲醇溶液(80%):将80mL甲醇与20mL水混合均匀。
3.2.3淋洗溶液:10mL水;10mL甲醇溶液(20%)。
3.2.4含0.1%甲酸的甲醇溶液:用甲醇将0.1mL甲酸定容至100mL。
3.3标准品
微囊藻毒素标准品:微囊藻毒素-LR (MC-LR,C49H74N10O12,CAS号101043-37-2)、微囊藻毒素-YR(MC-YR,C52H72N10O13,CAS号101064-48-6)、微囊藻毒素-RR (MC-RR,C49H75N13O12,CAS号111755-37-4),纯度均≥95%。
3.4标准溶液配制
3.4.1微囊藻毒素标准储备液(10μg/mL):分别称取微囊藻毒素标准品MC-LR、MC-YR、MC-RR各0.5mg(按实际含量折算,精确至0.01mg),用500μL甲醇溶解,再用水定容至50mL。标准储备液贮存于密闭棕色玻璃瓶中,于-20℃储存,有效期为3个月。
3.4.2标准中间液(10ng/mL):吸取微囊藻毒素标准储备液(10μg/mL)10μL于10mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度。标准中间液于-20℃冷冻避光保存,有效期为3个月。
3.4.3基质匹配的混合标准系列工作液:用空白基质溶液将微囊藻毒素标准中间溶液(10ng/mL)稀释成含量为0.1μg/L、0.2μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L和5.0μg/L的混合标准系列工作液。现用现配。
3.5材料
3.5.1固相萃取小柱:ODS C18柱,500mg/6mL,或性能相当者。
3.5.2有机相微孔滤膜:0.22μm。
3.5.3玻璃纤维滤纸:GF/F规格,或性能相当者。
4仪器和设备
4.1液相色谱-质谱仪:配有电喷雾离子源。
4.2分析天平:感量为0.001g和0.00001g。
4.3离心机:转速大于8000r/min。
4.4均质器。
4.5旋转蒸发仪。
4.6涡旋振荡器。
5分析步骤
5.1试样制备
取样品的可食部分约500g,充分均质或粉碎,装入洁净容器中,密封,并标明标记。试样置于
-18℃以下避光保存,一个月内须完成检测。
5.2提取
准确称取5g(精确至0.01g)试样,置于50mL离心管中,加入10mL甲醇溶液(80%),充分振荡
均匀,8000r/min离心10min,取上清液于新离心管中。残渣重复提取一次,合并两次提取液,提取液定容至30mL,以玻璃纤维滤纸过滤。取6mL滤液加入30mL水稀释。待净化。
5.3净化
C18固相萃取小柱使用前依次用10mL甲醇和10mL水活化,流速控制在1滴/s~2滴/s。将提取液全部过柱后,用10mL甲醇溶液(20%)淋洗,以10mL含有0.1%甲酸的甲醇溶液洗脱,收集洗脱液,以氮气浓缩至近干。加入1mL甲醇溶液(20%)充分溶解残渣,用有机相微孔滤膜过滤,待上机检测。
5.4空白对照试验
分别称取与待测样品基质相同、不含所测微囊藻毒素的空白试样10份于50mL离心管中。以下操作按5.2和5.3的操作处理。合并10份空白试样溶液,用微孔滤膜过滤。滤液可作为空白基质溶液配制基质匹配的混合标准系列工作液。
5.5仪器参考条件
5.5.1液相色谱参考条件
a)色谱柱:C18色谱柱,柱长250mm,内径2mm,粒径5μm,或同等性能色谱柱;
b)柱温:30℃;
c)流动相:流动相A为含有0.1%甲酸的甲酸铵溶液(5mmol/L);流动相B为,95%乙腈水溶液
(含有0.1%甲酸和5mmol/L甲酸铵)。梯度洗脱,梯度洗脱程序见表1。流速为0.3mL/min;
d)进样量:10μL。
5.5.2质谱参考条件
a)离子源:电喷雾离子源(ESI);
b)离子源电压:5500V;
c)离子源温度:650℃;
d)扫描方式:正离子扫描;
e)监测方式:多反应监测(MRM)模式,MRM参数见表2;
f)雾化气、气帘气、碰撞气、辅助加热气均为高纯氮气,使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求。
5.6标准曲线的制作
分别将10μL混合标准系列工作液按浓度由低到高的顺序注入液相色谱-质谱仪进行测定得到各微囊藻毒素的峰面积。以各微囊藻毒素的浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。微囊藻毒素标准溶液的多反应监测色谱图见图A.1。
5.7试样溶液的测定
将10μL试样溶液注入液相色谱-质谱仪,得到各微囊藻毒素的峰面积,根据标准曲线得到试样溶液中各微囊藻毒素的含量。
5.8定性
试样中微囊藻毒素色谱峰的保留时间与相应标准的色谱峰保留时间的偏差在±2.5%之内。试样中待测物的质谱定性离子至少应包括一个母离子和两个子离子,且试样中目标化合物的定性离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液中该化合物的定性离子的相对丰度比之间的偏差应在表3规定的范围。
6分析结果的表述
试样中微囊藻毒素的含量按式(1)计算:
式中:
X1——试样中微囊藻毒素的含量,单位为微克每千克(μg/kg);
A——根据标准曲线得到的试样溶液中微囊藻毒素的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL);
V——样液最终定容体积,单位为毫升(mL);
m——试样的质量,单位为克(g);
1000——单位换算因子。
结果保留三位有效数字。
7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
8其他
当取样量为5g时,MC-LR和MC-RR的检出限为0.3μg/kg,定量限为1μg/kg;MC-YR的检出
限为0.17μg/kg,定量限为0.5μg/kg。
第二法间接竞争酶联免疫吸附法
9原理
试样中的微囊藻毒素经提取及净化处理后与过量的针对微囊藻毒素的特异性抗体反应,多余的游离抗体则与酶标板内的预包被微囊藻毒素人工抗原结合。加入针对微囊藻抗体的酶标二抗和酶对应的底物显色,与微囊藻毒素标准的该反应结果比较,计算试样中微囊藻毒素的含量。
10试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。
10.1试剂
10.1.1抗微囊藻毒素(MC-LR)的单克隆抗体:杂交瘤技术制备,经亲和层析纯化。
10.1.2人工抗原:MC-LR-牛血清白蛋白偶联物(MC-LR-BSA)。
10.1.3牛血清白蛋白(BSA)。
10.1.4酶标二抗:辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗小鼠IgG。
10.1.5磷酸二氢钾(KH2PO4)。
10.1.6十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4•12H2O)。
10.1.7氯化钠(NaCl)。
10.1.8氯化钾(KCl)。
10.1.9三水合乙酸钠(CH3COONa•3H2O)。
10.1.10冰乙酸(CH3COOH)。
10.1.11硫酸(H2SO4)。
10.1.12明胶。
10.1.13吐温-20(C18H34O6)。
10.1.14四甲基联苯胺(C16H20N2)。
10.1.15二甲基亚砜(DMSO)。
10.1.16过氧化氢(H2O2)。
10.2试剂配制
10.2.1乙醇溶液(20%):将20mL乙醇与80mL水混合。
10.2.2标准品稀释液:称取0.005g明胶和0.1g叠氮化钠,用水溶解,定容至100mL。
10.2.3磷酸盐缓冲溶液(pH7.4):分别称取0.2g磷酸二氢钾、2.9g十二水合磷酸氢二钠、8.0g氯化钠、0.2g氯化钾,混合,用水溶解,定容至1000mL。
10.2.4乙酸钠溶液(0.1mol/L):称取1.36g三水合乙酸钠,用水溶解,定容至100mL。
10.2.5乙酸溶液(1mol/L):量取5.88mL冰乙酸,加水定容至100mL。
10.2.6硫酸溶液(1mol/L):量取55.6mL硫酸,沿玻棒缓缓注入约200mL水中,搅拌,冷却至室温,
加水定容至1000mL。
10.2.7包被溶液:称取1mg人工抗原,溶解于1000mL磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)中。
10.2.8封闭溶液:称取0.5g明胶,加少量磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4),加热溶解,冷却后定容至
1000mL。
10.2.9洗涤溶液(PBS-T):量取0.5mL吐温-20,用磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)定容至1000mL。
10.2.10抗体稀释溶液:称取0.5g明胶,加少量洗涤溶液,加热溶解,冷却后定容至1000mL。
10.2.11二抗溶液:1体积酶标二抗与5000体积抗体稀释溶液混合。
10.2.12底物缓冲溶液(pH5.0):用乙酸溶液(1mol/L)调整乙酸钠溶液的pH为5.0。
10.2.13底物贮备溶液:称取10mg四甲基联苯胺,溶于1mL二甲基亚砜中。
10.2.14底物溶液:量取100μL底物贮备溶液,加2μL30%过氧化氢和10mL底物缓冲溶液。临用时配制。
10.3标准品
微囊藻毒素-LR (MC-LR,C49H74N10O12,CAS号101043-37-2),纯度≥95%。
10.4标准溶液配制
微囊藻毒素(MC-LR)标准系列溶液:称取适量微囊藻毒素(MC-LR),用乙醇溶液(20%)配制成
MC-LR浓度为0.5mg/mL的溶液。再用标准稀释液稀释至MC-LR含量为10μg/mL的溶液。再用标准稀释液继续配制MC-LR含量分别为0.1μg/L、0.2μg/L、0.5μg/L、1μg/L、2μg/L的标准系列溶液。
11仪器和设备
11.1酶标仪:内置450nm滤光片。
11.2离心机:转速大于8000r/min。
11.3电动振荡器。
11.4恒温培养箱:可控温。
11.5氮气浓缩装置。
12分析步骤
12.1试样制备
同5.1。
12.2提取
同5.2。
12.3净化
C18固相萃取小柱使用前依次用10mL甲醇和10mL水活化,流速控制在1滴/s~2滴/s。将提取液全部过柱后,用10mL甲醇溶液(20%)淋洗,以10mL含有0.1%甲酸的甲醇溶液洗脱,收集洗脱液,以氮气浓缩至近干。用500μL水溶解残渣,待进行间接竞争酶联免疫反应测定。
12.4间接竞争酶联免疫反应
12.4.1包被酶标微孔板
将包被溶液加入酶标微孔板(100μL/孔),于4℃放置过夜。
12.4.2封闭酶标微孔板
用洗涤液洗涤放置过夜的酶标微孔板,洗涤3次,每次洗涤3min,加入封闭溶液封闭酶标微孔板(200μL/孔),于37℃下放置2h,或4℃下放置过夜。
12.4.3抗原
抗体反应量取500μL抗微囊藻毒素MC-LR的单克隆抗体和500μL微囊藻毒素标准系列溶液于1.5mL试管中,混合后用电动振荡器振荡均匀,室温静置30min。这些反应液用于制作微囊藻毒素标准竞争曲线。
量取500μL抗微囊藻毒素MC-LR的单克隆抗体和500μL净化液于1.5mL试管中,混合后用电动振荡器振荡,室温静置30min。此反应液用于测定试样中微囊藻毒素的含量。
12.4.4竞争反应
用洗涤液洗涤3次封闭过的酶标微孔板(每次洗涤3min),滴加抗体抗原反应溶液(100μL/孔)。不同浓度做3次平行试验。37℃或室温放置90min。在酶标微孔板的适当孔位滴加抗体稀释溶液,作为阴性对照。
12.4.5二抗溶液与抗微囊藻毒素(MC-LR)的单克隆抗体反应
用洗涤液洗涤3次竞争反应后的酶标微孔板(每次洗涤3min),滴加二抗溶液(100μL/孔),37℃或室温放置30min。
12.4.6显色及显色后吸光度的确定
用洗涤液洗涤5次经12.4.5反应的酶标微孔板(每次洗涤3min)。滴加底物溶液(100μL/孔),
37℃或室温放置15min~20min,显色。滴加硫酸(1mol/L)(50μL/孔),终止显色反应。
30min内,用酶标仪在450nm处,测定显色后的吸光度值。
12.5测定
12.5.1仪器参考条件
酶标仪:450nm。
12.5.2标准曲线的制作
标准系列溶液的吸光度值与阴性对照吸光度值的比值X2,按式(2)分别计算:
式中:
X2——吸光度比值;
OD1——标准系列溶液的吸光度平均值;
OD2——阴性对照吸光度平均值。
以标准系列溶液的浓度的对数为横坐标,以X2为纵坐标,绘制标准曲线。
12.5.3试样溶液测定
计算试样溶液的吸光度值与阴性对照吸光度值的比值,由标准曲线得到试样溶液中微囊藻毒素的浓度。
13分析结果的表述
试样中微囊藻毒素的含量X3,按式(3)计算:
式中:
X3——试样中微囊藻毒素的含量,单位为微克每千克(μg/kg);
A——试样溶液中微囊藻毒素的浓度,单位为微克每升(μg/L);
V——试样溶液的体积,单位为毫升(mL);
m——试样的质量,单位为克(g);
f——试样溶液的稀释倍数。
计算结果保留三位有效数字。
当酶联免疫法结果呈阳性样品需用第一法确认。
14精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
15其他
当取样量为5g时,MC-LR的检出限为0.03μg/kg,定量限为0.1μg/kg。
