中华人民共和国农业行业标准
NY/T 3942-2021
水果及其制品中L-苹果酸和D-苹果酸的测定
高效液相色谱法
Determination of L-malic acid and D-malic acid in fruits and their derived products-High performance liquid chromatography
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》和GB/T 20001.4-2015《标准编制规则第4部分:试验方法标准》的规定起草。
请注意本文件某些内容可能涉及专(zhuan)利。本文件的发布机构不承担识别专(zhuan)利的责任。
本文件由农业农村部种植业管理司提出。
本文件由全国果品标准化技术委员会(SAC/TC 501)归口。
本文件起草单位:中国农业科学院果树研究所、青岛农业大学、青岛市现代农业质量与安全工程重点实验室、山东农业工程学院。
本文件主要起草人:聂继云、匡立学、沈友明、佟瑶、程杨、徐国锋、李静、闫震、秦旭。
1范围
本文件规定了水果及其制品中L-苹果酸和D-苹果酸测定的高效液相色谱法。
本文件适用于水果及其制品中L-苹果酸和D-苹果酸含量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可(ke)少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法。
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试样用水提取,经固相萃取小柱净化,反相液相色谱分离,紫外检测器或二极管阵列检测器检测,以保留时间定性,峰面积外标法定证
5试剂或材料
除非另有说明,所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。
5.1乙酸铜[Cu2(CH3COO)4,CAS号:142-71-2]。
5.2 L-缬氨酸(C5H11NO2,CAS号:72-18-4)。
5.3甲醇(CH4O,CAS号:67-56-1):色谱纯。
5.4流动相:称取1.5961g乙酸铜(5.1)至1000 mL容量瓶中,加水浴解后,加入1.8744 g L-缬氨酸(5. 2),用水溶解并定容,过水相型微孔法膜(5.1)。
5.5 L-苹果酸(C4H6O5,CAS号97-67-6):纯度为99%,或经国家认证并授于标准物质证书的标准物质。
5.6 D-苹果酸(C4H6O5,CAS号636-61-3):纯度为99%,或当国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
5.7标准储备液(2.0 mg/mL):分别称取L-苹果酸(5.5)和D-苹果酸(5.6)各20 mg(精确至0.1 mg)于10 mL容量瓶中,用水溶解并定容,配制成2.0 mg/mL的标准储备液。4℃下保存,有效期3个月。
5.8标准工作溶液:分别量取0.05mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL L-苹果酸和D-苹果酸的标准储备液(5.7)于6个5 mL容量瓶中,定容,配制成混合标准溶液。混合标准溶液中L-苹果酸和D-苹果酸的浓度均为0. 020 mg/mL、0.20 mg/mL、0.40 mg/mL、0.60 mg/mL、0.80 mg/mL、1.00 mg/mL。
5.9净化柱:反相C18固相萃取小柱,200 mg/6 mL,或性能相当者。
5.10水相型微孔滤膜:孔径0. 45μm。
6仪器设备
6.1高效液相色谱仪:配紫外检测器或二极管阵列检测器。
6.2电子天平:感量0.01 g、0.1 mg。
6.3匀浆机。
6.4超声波清洗机:频率不低于40 kHz。
6.5冷冻研磨仪。
6.6离心机:转速不低于9 000 r/min。
6.7固相萃取装置。
7试样的制备
7.1新鲜水果
新鲜水果洗净擦干,取代表性的可食部分约1kg,切碎,用匀浆机制成匀浆,装入洁净容器,密封,-18℃以下冷冻保存。
7.2果汁
7.2.1带果肉果汁
用匀浆机制成匀浆,装入洁净容器,密封,-18℃以下冷冻保存。
7.2.2不带果肉果汁
摇匀,装入洁净容器,密封,-18℃以下冷冻保存。
7.3水果干制品
样品切成约2 mmX2 mm的小块,液氨冷冻研磨成粉末,装入洁净容器,密封,-18℃以下冷冻保存。
7.4水果罐头类
取罐头全部内容物,用匀浆机制成匀浆,装入洁净容器,密封,-18℃以下冷冻保存。
8分析步骤
8.1试样溶液的制备
称取5g(精确至0.01g)均匀试样至50mL塑料离心管中,加入20mL水,摇匀,40kHz频率下常温超声提取20min,9000r/min离心15min,上清液转移至50mL容量瓶中,残渣再用10mL水按上述步骤重复提取1次,合并2次提取液,用水定容至刻度,摇匀,得到样品提取液。依次用5 mL甲醇(5.3)和5 mL水预淋洗、活化固相萃取小柱(5.9)。吸取5 mL样品提取液加入活化好的固相萃取小柱中,弃去2 mL初始滤液,收集滤液供高效液相色谱仪分析测定。
8.2液相色谱参考条件
a)色谱柱:C18色谱柱,250 mm×4.6mm×5μm,或等效的色谱柱;
b)柱温:30℃;
c)流速:1 mL/min;
d)进样量:10μL;
e)检测波长:302 nm;
D)流动相(5. 4)洗脱:等度洗脱30 min。
8.3标准工作曲线绘制
按照8.2设定的液相色谱工作条件,待仪器稳定后,依次测定系列标准工作溶液(5.8)中L-苹果酸和D-苹果酸的色谱峰面积。以系列标准工作溶液(5.8)中L-苹果酸和D-苹果酸的浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制L-苹果酸和D-苹果酸的浓度-色谱峰面积标准曲线。标准品色谱图见附录A。
8.4试样溶液的测定
将试样溶液注入高效液相色谱仪,得到色谱峰面积。根据标准曲线得到待测液中L-苹果酸和D-苹果酸的浓度。若试样溶液中测定组分浓度超过标准曲线上限,应稀释至标准曲线浓度范围再行测定。
8.5空白试验
除不加入试样外,采用完(wan)全相同的分析步骤进行测定。
9结果计算和表述
试样中L-苹果酸、D-苹果酸含量按公式(1)计算。
式中:
ω——试样中L-苹果酸或D-苹果酸的含量的数值,单位为克每千克(g/kg);
C——试样溶液中L-苹果酸或D-苹果酸的浓度的数值,单位为毫克每毫升(mg/mL);
C0——空白溶液中L-苹果酸或D-苹果酸的浓度的数值,单位为毫克每毫升(mg/mL);
V——提取液体积的数值,单位为毫升(mL);
f——试样溶液稀释倍数;
m——试样的质量的数值,单位为克(g)。
计算结果≥10.0 g/kg时,保留3位有效数字;计算结果<10.0 g/kg时,保留2位有效数字。
10精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10%。
在再现性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的15%。
11检出限和定量限
当称样量为5.0 g时,L-苹果酸和D-苹果酸的检出限为0.030 g/kg,定量限为0.10 g/kg。