中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 5511-2023
出口调味料、调味面制品及肉制品中罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡和可待因的测定液相色谱-质谱/质谱法
Determination of papaverine，noscapine，thebaine，morphine and codeine in flavoring，seasoned flour products and meat products for export-LC-MS/MS method
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》、
GB/T 20001.4-2015《标准编写规则第4部分：试验方法标准》和SN/T 0001-2016《出口食品、化妆品理化测定方法标准编写的基本规定》的规定起草。
请注意文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位：银川海关技术中心、西安海关技术中心、合肥海关技术中心、宁夏回族自治区食品检测研究院、宁夏农产品质量标准与检测技术研究所、杭州海关技术中心。
本文件主要起草人：王芳焕、李子豪、宋伟、陈林、马桂娟、贺生芳、杨春霞、李婧、郝俊虎、孙敏、李竹岩、谢文。
1范围
本文件规定了出口调味料、调味面制品及肉制品中罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡和可待因的液相色谱-质谱/质谱检测方法。
本文件适用于固体调味料、调味面制品、肉制品、火锅调味料、调味油及含有固体调味粉的汤料等等食品中罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡和可待因的定性鉴别及定量测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法。
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4方法原理（提要）
采用盐酸溶液提取样品中的罂粟碱五项，用正己烷脱油脂，固相萃取柱净化，液相色谱-质谱/质谱仪测定，罂粟碱、那可丁和蒂巴因采用外标法定量，吗啡和可待因采用内标法定量。
5试剂和材料
除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
5.1甲醇：色谱纯。
5.2乙腈：色谱纯。
5.3氨水。
5.4浓盐酸。
5.5乙酸铵。
5.6正己烷：色谱纯。
5.7盐酸溶液（0.1 mol/L）：量取盐酸8.33 mL（5.4），加水至1 L，摇匀备用。
5.8氨化甲醇溶液（5+95，v/v）：量取氨水（5.3）5 mL，加甲醇（5.1）至100 mL，摇匀备用。
5.9乙酸铵溶液（5 mmol/L）：准确称取0.77 g乙酸铵（5.5）溶解于适量水中，定容至2 L，混匀备用。
5.10乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液（95+5，v/v）：量取95 mL乙腈和5 mL 5 mmol/L乙酸铵溶液（5.10），混匀。
5.11甲醇-水溶液（1+1，v/v）：量取50 mL甲醇和50 mL水，混匀。
5.12罂粟碱标准物质（Papaverine）：C20H21NO4，CAS NO.58-74-2；吗啡标准物质（Noscapine）：
C22H23NO7，CAS NO.128-62-1；蒂巴因（Thebaine）：C19H21NO3，CAS NO.115-37-7；吗啡标准物质（Morphine）：C22H23NO7，CAS NO.57-27-2；可待因标准物质（Codeine）：C18H21NO3，CAS NO.76-57-3；吗啡-D3（Morphine-D3）：C17H16D3NO3，CAS NO.67293-88-3；可待因- D3（Codeine-D3）：C18H18D3NO3，CAS NO.105843-36-5。纯度均大于等于98%。
5.13标准储备液（1.0 mg/mL）：精密称取盐酸罂粟碱、那可丁、吗啡、可待因和蒂巴因标准品适量（5.12），用甲醇（5.1）配制成罂粟碱、那可丁、可待因、吗啡和可待因的浓度均为1.0 mg/mL的溶液，作为标准储备液。4℃避光保存，有效期六个月。
5.14混合标准品溶液：精密吸取浓度为1.0 mg/mL的罂粟碱、那可丁、蒂巴因储备液各1.0 mL和浓度为1.0 mg/mL的吗啡、可待因储备液各5 mL于20 mL容量瓶中，用甲醇（5.1）定容至刻度，摇匀，即得含有罂粟碱、那可丁、蒂巴因浓度为50μg/mL和吗啡、可待因浓度为250μg/mL的混合标准品溶液。4℃避光保存，有效期三个月。
5.15同位素内标工作溶液（5.0μg/mL）：分别精密称取内标物质（5.12）适量，用甲醇（5.1）配制成浓度为5.0μg/mL的混合标准溶液。4℃避光保存，有效期三个月。
5.16标准工作溶液的配制：分别精密吸取上述混合标准品溶液（5.14）和同位素内标工作溶液（5.15）适量，用乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液（5.10）稀释成罂粟碱、那可丁、蒂巴因浓度为1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL，吗啡、可待因浓度分别为5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL的系列标准工作溶液，内标溶液浓度均为20.0 ng/mL。临用新配。
5.17固相萃取柱：N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯共聚物基质-SO3H，60 mg，3 mL或相当者。使用前用5 mL甲醇（5.1），5 mL 0.1 mol/L盐酸（5.7）活化。
5.18微孔滤膜：0.22μm，有机相针式过滤器。
6仪器和设备
6.1液相色谱-质谱/质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）。
6.2分析天平：感量为0.01 g和0.000 1 g。
6.3离心机，转速不小于4 000 r/min。
6.4固相萃取装置。
6.5氮吹仪。
7分析步骤
7.1样品制备与保存
7.1.1固体调味料、调味面制品、肉制品、火锅调味料
取出有代表性样品约500 g，用粉碎机全部粉碎后充分混匀，均匀分成二份作为试样，分装入洁净的容器内，密封并做好标记，于-18℃以下温度保存。
7.1.2调味油、含有固体调味粉的汤料
取代表性样品约500 g，装入洁净的容器中，密封并标识，于-18℃以下温度保存。
7.2提取
称取约2 g试样（精确至0.01 g），置于50 mL离心管中，加入8μL同位素内标工作液（5.15），加入10 mL 0.1 mol/L盐酸溶液（5.7）超声10 min，4 000 r/min离心5 min后，加入2 mL正己烷（5.6），静置，待净化。
7.3净化
分别用5 mL甲醇（5.1），5 mL 0.1 mol/L盐酸（5.7）活化固相萃取柱（5.17），移取5 mL提取液（7.2）通过固相萃取柱，再加5 mL 0.1 mol/L盐酸（5.7），5 mL甲醇-水溶液（5.11）淋洗固相萃取柱，吹干，最后用5 mL氨化甲醇（5.8）洗脱，收集全部流出液，35℃氮气吹干。用1 mL乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液（5.10）溶解残渣，涡旋2 min，过0.22μm有机相微孔滤膜后（5.18），供LC-MS/MS测定。
7.4测定
7.4.1液相色谱条件
液相色谱条件如下：
a）液相色谱柱：HILIC色谱柱，100 mm×2.1 mm（内径），1.7μm，或性能相当者。
b）流动相：A为乙腈，B为5 mmol/L乙酸铵溶液。
c）柱温：35±1℃。
d）进样量：5.0μL。
e）流速：0.3 mL/min。
f）流动相及梯度洗脱条件：见表1。
表1液相色谱梯度洗脱程序
时间/min |
乙腈/% |
5 mmol/L乙酸铵溶液/% |
0.00 |
95 |
5 |
2.00 |
95 |
5 |
4.00 |
85 |
15 |
6.50 |
70 |
30 |
7.00 |
95 |
5 |
9.00 |
95 |
5 |
7.4.2质谱参考条件
质谱条件如下：
a）离子源：电喷雾离子源（ESI）；
b）扫描方式：正离子扫描；
c）检测方式：多反应监测（MRM）；
d）雾化气、干燥气、辅助气为高纯氮气、碰撞气为高纯氩气；使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求。参考条件见附录A。
7.4.3定性测定
按照液相色谱-质谱/质谱条件测定样品和标准工作溶液，如果检测的的质量色谱峰保留时间与标准品保留时间相差不超过±2.5%，定性离子对的相对丰度（是用相对于最强离子丰度的强度百分比表示）与浓度相当的标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。
7.4.4定量测定
在仪器最佳状态下，将系列标准工作溶液（5.16）按浓度由低到高进样检测，以定量子离子峰面积-浓度作图，得到标准曲线。待测样液中罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡和可待因的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释至相应范围内再进样分析。罂粟碱、那可丁、蒂巴因采用外标法定量，吗啡、可待因采用内标法定量。在上述色谱条件下，罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡、可待因吗啡-D3和可待因-D3的多反应监测（MRM）色谱图参见附录B，出峰时间分别为4.02 min、3.08 min、4.96 min、5.41 min、5.34 min、5.41 min和5.34 min。
7.4.5空白试验
除不加试样外，按上述测定步骤进行。
7.4.6结果计算与表述
试样中待测物的含量由色谱数据处理软件或按式（1）计算获得，计算结果需扣除空白值。
式中：
X——试样中被测物残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；
c——从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
V——样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；
m——样液相当的试样质量，单位为克（g）。
8定量限与回收率
8.1定量限（LOQ）
本方法罂粟碱、那可丁、蒂巴因和吗啡、可待因的定量限分别为2μg/kg、2μg/kg、2μg/kg、10μg/kg、10μg/kg。
8.2回收率
在三个添加浓度范围内，固体调味料、调味面制品、肉制品、火锅调味料、调味油及含有固体调味粉的汤料中罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡和可待因不同添加水平的平均回收率数据参见附录C。
