中华人民共和国国家标准
GB/T 42114-2022
木薯叶片中黄酮醇的测定 高效液相色谱法
Determination of flavonol in cassava leaves-
High-performance liquid chromatography
1范围
本文件描述了木薯(Manihot esculenta Crantz,Cassava)叶中4种黄酮醇化合物的高效液相色谱测定方法。
本文件适用于木薯鲜叶和木薯干叶中杨梅苷、芦丁、烟花苷和水仙苷4种黄酮醇含量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)话用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
木薯叶片试样中加入50%乙醇水溶液，经超声波辅助提取，高效液相色谱仪分离，紫外检测器或二极管阵列检测器检测，根据保留时间定性和外标法定量。
5试剂和材料
除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂，以及符合GB/T 6682规定的一级水。
5.1试剂
5.1.1甲醇(CH3OH，CAS号：67-56-1)：色谱纯。
5.1.2无水乙醇(CH3CH2OH，CAS 号：64-17-5)：色谱纯。
5.1.3 磷酸(H3PO4，CAS号：7664-38-2)。
5.2试剂配制
5.2.1 50%乙醇水溶液(体积分数)：取500 mL无水乙醇(5.1.2)，加入500 mL水，混匀。
5.2.2 0.2%磷酸水溶液(体积分数)：取2.0 mL磷酸(5.1.3)，置于1 000 mL容量瓶中，用水定容至刻度，现配现用。
5.3标准品
5.3.1杨梅苷(myricetin-3-O-rutinoside，C27H30O17，CAS号：41093-68-9)：纯度≥98.0%。
5.3.2芦丁(quercetin 3-O-rutinoside，C27H30O16，CAS号：153-18-4)：纯度≥98.0%。
5.3.3烟花苷(kaempferol-3-O-rutinoside，C27H30O15，CAS号：17650-84-9)：纯度≥98.0%。
5.3.4水仙苷(isorhamnetin-3-O-rutinoside，C28H32O16，CAS号：604-80-8) ：纯度≥98.0%。
5.4标准溶波配制
5.4.1标准储备溶液
称取杨梅苷、芦丁、烟花苷和水仙苷标准品分别为100.0mg、600.0mg、300.0mg和100.0mg，加甲醇(5.1.1)溶解并定容至100 mL，配成质量浓度分别为1.0 mg/mL、6.0 mg/mL、3.0 mg/mL和1.0 mg/mL标准储备液，于-18℃密封避光保存。保存期6个月。
5.4.2 标准中间工作溶液
分别移取1.0 mL，的杨梅苷、芦丁、烟花苷、水仙苷标准储备溶液(5.4.1)于10 ml，棕色容量瓶中，用50%乙醇水溶液(5.2.1)定容，获得4种黄酮醇标准品质量浓度分别为100.0 μg/mL、600.0 μg/ mL、300.0 μg/ mL、100.0 μg/mL标准中间工作溶液，现配现用。
5.4.3系列混合标准工作液
准确移取一定体积的标准中间工作溶液(5.4.2)，用50%乙醇水溶液(5.2.1)逐级稀释，配制成杨梅苷质量浓度分别为0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、2.5 μg/mL、5.0 μg/mL、 25.0 μg/mL、50.0 μg/mL、100.0 μg/mL，芦丁质量浓度分别为0.15 μg/mL、3.0 μg/ mL、15.0 μg/ mL、30.0 μg/ mL、150.0 μg/ mL、300.0 μg/ mL、600.0 μg/ mL，烟花苷质量浓度分别为0.15 μg/mL、1.5 μ/mL、7.5 ug/mL、15.0 μg/mL、75.0 μg/mL、150.0 μg/ mL、300.0 μg/ mL，水仙苷质量浓度分别为0.15 μg/mL、0.5 μg/mL、2.5 μ/mL、5.0 μg/mL、25.0 μg/mL、50.0 μg/mL，100.0 μg/mL的系列混合标准工作液，现配现用。
6仪器与设备
6.1 高效液相色谱仪：配备紫外检测器或二极管阵列检测器。
6.2天平：感量0.1 mg和0.01 g。
6.3超声波清洗器：功率≥500 W。
6.4离心机：转速≥4 200 r/min，配15 ml，转子或适配器。
6.5电热恒温干燥箱。
6.6植物组织研磨仪。
6.7旋涡混合器。
6.8 离心管：15 mL和50 mL。
6.9容量瓶：10 mL和1 000 mL。
6.10 移液管：0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL和1.0 mL。
6.11 PTFE亲水微孔滤膜或相当性能的滤膜：孔径0.22μm。
7试样制备与保存
7.1木薯鲜叶
取适量木薯新鲜叶片(不带叶柄)。擦拭干净表面尘土或水分，用液氮速冻后研磨至粉末，装入洁净的离心管中。试样制备后于-18℃以下密封避光保存。保存期1年。
7.2木薯干叶
取适量的木薯干叶(不带叶柄)，用植物组织研磨仪研磨至粉末，过0.2 mm的筛，混匀，装入洁净的密封袋中。试样制备后于8℃以下密封避光保存。保存期1年。
8测定步骤
8.1提取
准确称取木薯鲜叶或木薯干叶粉末0.2g(±0.0002g)于15mL离心管中，加入50%乙醇水溶液(5.2.1)5.0 mL，旋涡振荡混匀，超声提取60 min(50℃，500 W)，离心10 min(4 200 r/min，25℃)，上清液转移至10 mL容量瓶中，残渣再加入50%乙醇水溶液(5.2.1)5.0 mL，旋涡振荡混匀，离心5 min(10000 r/min， 25℃)，合并两次离心的上清液，加入50%乙醇水溶液(5.2.1)定容至10 mL，旋涡振荡混匀，即待测样品溶液。取1.0 mL待测样品溶液，通过0.22 μm微孔滤膜(6.11)，供高效液相色谱仪检测。
8.2 测定
8.2.1色谱参考条件
高效液相色谱仪(6.1)的色谱参考条件如下：
a)C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)或性能相当的色谱柱；
b)流动相：甲醇和0.2%磷酸水溶液，按表1的规定进行梯度洗脱；
c)流速：0.8 mL/min；
d)检测波长：360nm；
e)进样量：10μL；
f)柱温：40℃。
8.2.2标准曲线的制怍
取适量标准中间工作溶液(5.4.2)，用50%乙醇稀释成系列混合标准工作液(5.4.3)，杨梅苷、芦丁、烟花苷和水仙苷质量浓度范围分别为：0.25 mg/L~ 100.0 mg/L、0.15 mg/L~600.0 mg/L、0.15 mg/L~300.0 mg/L和0.15 mg/L~ 100.0 mg/L。按照8.2.1规定的色谱条件测定，以标准溶液质量浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，建立标准工作曲线。4种黄酮醇标准溶液色谱图见附录A。
8.2.3试样溶液的测定：
按照8.2.1规定的色谱条件，将待测样品溶液(8.1)注入高效液相色谱仪(6.1)中进行测试，根据标准溶液色谱峰的保留时间进行定性。试样溶液中4种黄酮醇的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围应稀释后再进行分析，外标法定量。
9结果计算与表述
9.1 木薯叶片中黄酮醇各组分含量
试样中木薯叶黄酮醇各组分含量，按式(1)计算。
式中：
X——试样中某一黄酮醇组分含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；
ρi——从标准工作曲线得到的试样溶液中各组分的质量浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；
V——试样提取液定容体积，单位为亳升(mL)；
1000——单位换算系数；
m——试样质量，单位为克(g)；
f——稀释倍数。
9.2 木薯叶黄酮醇总含量
试样中黄酮醇总含量为各组分之和，按式(2)计算。
式中：
X——试样中黄酮醇总含量，单位为毫克每千克( mg/kg)；
Xi——试样中某一黄酮醇组分含量，单位为毫克每千克(mg/kg)。
注：本文件中4种黄酮醇已包括木薯叶片中黄酮醇的绝大部分含量，可视为木薯叶片中黄酮醇总含量。
9.3结果表示
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留至小数点后一位。
10精密度
10.1 重复性
在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过算术平均值的10%。
10.2再现性
在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过算术平均值的15%。
11 检出限和定量限
本方法测定黄酮醇的检出限和定量限见表2。
