中华人民共和国水产行业标准
SC/T 3057-2022
水产品及其制品中磷脂含量的测定液相色谱法
Determination of phosphatide in fish and fishery products
-Liquid chromatography
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出。
本文件由全国水产标准化技术委员会水产品加工分技术委员会（SAC/TC 156/SC 3）归口。
本文件起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、国家水产品质量检验检测中心、中国水产科学研究院黑龙江水产研究所。
本文件主要起草人：王联珠、彭吉星、孙言春、谭志军、郭莹莹、赵新楠、朱文嘉、文艺晓、吴海燕、郭萌萌、郑关超。
1范围
本文件描述了用液相色谱法测定水产品及其制品中磷脂含量的原理、试剂和材料、仪器和设备、试样制备与保存、测定步骤、结果计算、方法灵敏度和精密度。
本文件适用于鱼、贝、虾等水产品及其制品中磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱、鞘磷脂、溶血磷脂酰胆碱5种磷脂含量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 15687动植物油脂试样的制备
GB/T 30891-2014水产品抽样规范
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试样中磷脂经氧仿-甲醇溶液提取、固相萃取柱净化，液相色谱蒸发光散射检测器检测，外标法定量。
5试剂和材料
警示：应当严格遵循石毒物质的使用规程。采取有效措施保证组织和个人安全。
除另有说明，所有试剂好为色谱纯，试验用水应符合GB/T 6682一级水的要求。
5.1试剂
5.1.1正己烷（C6H14）。
5.1.2异丙醇（C3H8O）。
5.1.3氯仿（CHCl3）。
5.1.4甲醇（CH3OH）。
5.1.5乙酸（CH3COOH）。
5.1.6乙醚（C4H10O）。
5.1.7三乙胺（C6H15N）。
5.1.8盐酸（HCl）：优级纯。
5.1.9氯化钠（NaCl）：优级纯。
5.1.10无水硫酸钠（Na2SO4）：优级纯，120℃烘干4 h，干燥器内冷却至室温，储于密封瓶中备用。
5.1.11正己烷-异丙醇溶液（2+3）：量取40mL正己烷和60mL异丙醇，混匀。
5.1.12氯仿-甲醇溶液（9+1）：量取9mL氯仿和1mL甲醇，混匀。
5.1.13氯仿-甲醇溶液（2+1）：量取200mL氯仿和100mL甲醇，混匀。
5.1.14 0.9%氯化钠溶液：称取9g氯化钠，加1000mL水溶解。
5. 1.15氯仿异丙醇溶液（2+1）：量取200 mL氣仿和100 mL异丙醇，混匀。
5.1.16乙酸-乙醚溶液（1+72）：量取4 mL乙酸和288 mL乙醚，混匀。
5.1.17 2%盐酸溶液：量取5.4mL盐酸，加水定容至100mL，混匀。
5.1.18氯仿-甲醇-盐酸溶液（200+100+1）：取200mL氯仿和100 mL甲醇，加入1 mL 2%盐酸溶液，混匀。
5.1.19 0.04%三乙胺正己烷溶液：准确量取0. 4 mL三乙胺，加正己烷定容至1 000 mL，混匀。
5.1.20 13%乙酸溶液：准确量取130 mL乙酸，加水定容至1 0000 mL，混匀。
5.2标准品
宜选择动物性来源标准品，5种磷脂标准品详细信息见附录A。
5.3标准溶液配制
5.3.1单-标准储备液
分别准确称取各磷脂标准品适量（精确至0.1 mg），其中磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、鞘磷脂和溶血磷脂酰胆碱用正己烷-异丙醇溶液（5.1.11）溶解，磷脂酰肌醇先用0.5 mL氯仿-甲醇溶液（5.1.12）溶解后再加入正己烷异丙醇溶液（5.1.11）稀释并定容，配制成质量浓度分别为磷脂酰乙醇胺1 000 mg/L、磷脂酰肌醇1 000 mg/L、磷脂酰胆碱3 000 mg/L、鞘磷脂1 000 mg/L和溶血磷脂酰胆碱2 000 mg/L的单一标准储备液，于-18℃下避光密封保存，有效期为1个月。
5.3.2混合标准中间液
分别准确移取1.8mL各磷脂单-标准储备液于同一10mL棕色容量瓶中，用正己烷-异丙醇溶液（5.1.11）稀释并定容，配制成质量浓度分别为磷脂酰乙醇胺180 mg/L、磷脂酰肌醇180 mg/L、磷脂酰胆碱540 mg/L、鞘磷脂180 mg/L和溶血磷脂酰胆碱360 mg/L的混合标准中间液，现用现配。
5.3.3系列混合标准工作溶液
分别准确移取适量混合标准中间液于10 mL棕色容量瓶中，用正己烷-异丙醇溶液（5.1. 11）稀释配制成质量浓度分别为磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和鞘磷脂：10mg/L、30mg/L、45mg/L、90mg/L、180 mg/L，磷脂酰胆碱：30 mg/L、90 mg/L、135 mg/L、270 mg/L、540 mg/L；溶血磷脂酰胆碱：20 mg/L、60 mg/L、90 mg/L、180 mg/L、360 mg/L的系列混合标准工作溶液，现用现配。
5.4材料
氨基固相萃取柱：1 000 mg/6 mL，或性能相当者。
6仪器和设备
6.1液相色谱仪：配蒸发光散射检测器。
6.2天平：感量为0.1 mg，0.001 g和0.01 g。
6.3涡旋振荡器。
6.4离心机：转速≥4 000 r/min。
6.5氮吹仪。
6.6超声波清洗仪。
6.7固相萃取装置。
7试样制备与保存
7.1试样制备
湿基试样制备按照GB/T 30891-2014中附录B的规定执行；干制品试样至少200 g，粉碎后全部过0.42mm孔径分析筛，充分混匀后装入洁净容器中密封备用；油脂试样参照GB/T 15687的规定执行，分取50g装入洁净容器中密封备用。
7.2试样保存
-18℃以下避光保存。
8测定步骤
8.1提取和净化
8.1.1固体试样
8.1.1.1提取
湿基试样称取1 g~2 g（精确至0.01 g），干制品试样称取0.1 g~0.2 g（精确至0.001 g），置于50 mL离心管中，加入15 mL氯仿甲醇溶液（5.1.13），涡旋混合后超声提取30 min，4 000 r/min离心5 min，收集上清液，残渣再加入15 mL氯仿甲醇溶液（5.1.13）重复上述操作2次，合并上清液至分液漏斗中，加入10 mL，氯化钠溶液（5.1.14），振荡摇匀后静置分层，收集下层提取液，加入适量无水硫酸钠（5.1.10）脱水过滤，30℃氮吹至近千，加入2 mL氯仿（5.1.3）溶解，待净化。
8.1.1.2净化
氨基固相萃取柱先用5 mL氯仿活化，将待净化液移入氨基固相萃取柱（5.4），依次用10 mL氯仿-异丙醇溶液（5.1.15）和10mL乙酸-乙醚溶液（5.1.16）淋洗小柱，再依次用10mL甲醇和10mL氯仿-甲醇盐酸溶液（5.1.18）洗脱，收集全部洗脱液，于30℃下氮吹至近干，加入正己烷-异丙醇溶液（5.1.11）溶解并定容至10 mL，过0.45μm尼龙滤膜后待测。
8.1.2油脂试样
称取0.2 g~0.5 g油脂试样（精确至0.001 g），加入氯仿（5.1.3）溶解并定容至10 mL，准确移取1 mL按照8.1.1.2进行净化操作。
8.2测定
8.2. 1色谱参考条件
a）色谱柱：硅胶整体柱（100mm×4.6mm），或性能相当者；
b）柱温：30℃；
c）进样量：20μL，；
d）流速：1.5mL/min；
e）载气压力：50PSI；
f）漂移管温度：65℃，喷雾器：加热模式75%；
g）流动相：A相0.04%三乙胺正己烷溶液（5.1.19），B相异丙醇（5.1.2），C相13%乙酸溶液（5.1.20）；梯度洗脱程序见表1。
8.2.2标准曲线绘制
将系列混合标准工作液（5.3.3）分别注入液相色谱仪中，以系列标准溶液中各磷脂质量浓度的对数值为横坐标、以相应色谱峰峰面积的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。5种磷脂混合标准工作溶液的液相色谱图见附录B。标准曲线方程依蒸发光散射检测原理，按公式（1）计算。
式中：
y——峰面积；
x——磷脂标准溶液质量浓度的数值，单位为毫克每升（mg/L）；
a、b——与蒸发温度、流动相性质等条件有关的常数。
8.2.3试样溶液测定
取试样溶液注入液相色谱仪中，按8.2.1的色谱条件进行测定，记录色谱峰的保留时间和峰面积，外标法定量。试样溶液中各磷脂色谱峰保留时间与相应磷脂标准色谱峰保留时间的相对偏差不应大于5.0%。试样溶液中各磷脂的响应值应在标准曲线范围内，超出范围的试样溶液可适当稀释后再进行测定。
8.3空白试验
除不称取试样外，采用完全相同的测定步骤进行测定。
9结果计算
试样中各磷脂的含量按公式（2）计算
式中：
Xi——试样中各磷脂含量的数值，单位为毫克每克（mg/g）；
Ci——从标准曲线得到的试样溶液中各磷脂质量浓度的数值、单位为毫克每升（mg/L）；
V——试洋溶液最终定容体识的数值，单位为毫升（mL）。
F——稀释倍数。
m——试样质量的数值，单位为克（g）；
1000——换算系数。
计算结果以重复性条件下2欢独立测定结果的算术平均值表示，结果保留至小数点后2位。
10方法灵敏度和精密度
10. 1方法检出限和定量限
固体试样的方法检出限和定量限见表2，油脂试样的方法检出限和定量限见表3。
表2固体试样方法检出限和定量限
磷脂类化合物 |
检出限，mg/g |
定量限，mg/g |
磷脂酰乙醇胺 |
0.10 |
0.2 |
磷脂酰肌醇 |
0.10 |
0.2 |
磷脂酰胆碱 |
0.30 |
0.6 |
鞘磷脂 |
0.10 |
0.2 |
溶血磷脂酰胆碱 |
0.20 |
0.4 |
表3油脂试样方法检出限和定量限
磷脂类化合物 |
检出限，mg/g |
定量限，mg/g |
磷脂酰乙醇胺 |
2.00 |
4.00 |
磷脂酰肌醇 |
2.00 |
4.00 |
磷脂酰胆碱 |
6.00 |
12.00 |
鞘磷脂 |
2.00 |
4.00 |
溶血磷脂酰胆碱 |
4.00 |
8.00 |
10.2精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
