中华人民共和国国家标准
GB 31656.14-2022
食品安全国家标准
水产品中27种性激素残留量的测定液相色谱-串联质谱法
National food safety standard-
Determination of 27 sex hormones residues in fishery products
by liquid chromatography-tandem mass spectrometric
1范围
本文件规定了水产品中27种性激素残留量检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于鱼、虾和蟹可食部分中己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、己烷雌酚、雌二醇、雌三醇、炔雌醇、苯甲酸雌二醇、群勃龙、诺龙、雄烯二酮、勃地酮、睾酮、炔诺酮、美雄酮、甲基睾酮、康力龙、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、孕酮、21a-羟基孕酮、17a-羟基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲羟孕酮和左炔诺孕酮残留量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 30891-2014水产品抽样规范
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试样中残留的性激素用乙酸乙酯-甲基叔丁基醚混合溶剂和乙酸乙酯依次提取，提取液经浓缩、C18固相萃取柱净化，用液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。
5试剂与材料
以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯；水为符合GB/T 6682规定的一级水。
5.1试剂
5. 1.1甲醇（CH3OH）：色谱纯。
5. 1.2正己烷（C6H14）：色谱纯。
5.1.3甲基叔丁基醚（C5H12O）：色谱纯。
5.1.4乙酸乙酯（C4H8O2）：色谱纯。
5. 1.5冰乙酸（CH3COOH）。
5. 1.6三水乙酸钠（C2H3NaO2·3H2O）。
5. 1.7氨水（NH3·H2O）。
5.2溶液配制
5.2.1乙酸-乙酸钠缓冲溶液：取三水乙酸钠21.5g、冰乙酸2.6mL，加水适量使溶解并稀释至500mL，混匀。
5.2.2 0.02%氨水：取氨水100μL于500 mL水中，混匀。临用前配制。
5.2.3乙酸乙酯-甲基叔丁基醚溶液：取乙酸乙酯和甲基叔丁基醚等体积混合。
5.3标准品
5.3. 1性激素：己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、己烷雌酚、雌二醇、雌三醇、炔雌醇、苯甲酸雌二醇、群勃龙、诺龙、雄烯二酮、勃地酮、睾酮、炔诺酮、美雄酮、甲基睾酮、康力龙、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、孕酮、21a-羟基孕酮、17a-羟基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲羟孕酮和左炔诺孕酮：含量≥97%，具体见附录A。
5.3.2内标：己烯雌酚-D8、雌酮-D2、雌二醇-13C2、甲基睾酮-D3、孕酮-D9、左炔诺孕酮-D6和甲羟孕酮-D3；含量≥97%，具体见附录A。
5.4标准溶液制备
5. 4.1标准储备液：取性激素类标准品各10 mg，精密称定，分别用甲醇适量使溶解并定容于100 mL棕色容量瓶，配制成浓度均为100μg/mL的标准储备液。-18℃以下保存，有效期1年。
5. 4.2混合标准中间液：准确量取各标准储备液适量，于100 mL棕色容量瓶，用甲醇稀释配制成己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、群勃龙、诺龙、雄烯二酮、勃地酮、睾酮、美雄酮、甲基睾酮、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、孕酮、21a-羟基孕酮、17a-羟基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲羟孕酮浓度均为1μg/mL；己烷雌酚、雌二醇、左炔诺孕酮、炔诺酮、苯甲酸雄二醇和康力龙浓度均为2μg/mL；雌三醇和炔雌醇浓度均为4μg/mL的混合标准中间液。- 18℃以下保存，有效期6个月。
5.4.3混合标准工作液：准确量取混合标准中间液10mL，于50mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、群勃龙、诺龙、雄烯二酮、勃地酮、睾酮、美雄酮、甲基睾酮、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、孕酮、21a-羟基孕酮、17a-羟基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲羟孕酮浓度均为0.2μg/mL；己烷雌酚、雌二醇、左炔诺孕酮、炔诺酮、苯甲酸雌二醇和康力龙浓度均为0.4μg/mL；雌三醇和炔雌醇浓度均为0.8μg/mL的混合标准工作液。-18℃以下保存，有效期3个月。
5.4.4内标标准储备液：取同位素内标物各10 mg，精密称定，分别用甲醇适量使溶解并定容于50 mL棕色容量瓶，配制成浓度为200μg/mL的内标单标储备溶液。-18℃以下保存，有效期1年。
5. 4.5混合内标工作液：分别准确量取内标储备液适量，于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成雌二醇-13C2浓度为2μg/mL；己烯雌酚-D8、雌酮-D2、甲基睾酮-D3、孕酮-D9、甲羟孕酮-D3和左炔诺孕酮-D6浓度均为1μg/mL的混合内标工作液。-18℃以下保存，有效期6个月。
5.5材料
5.5.1C18固相萃取柱：500 mg/3 mL，或相当者。
5.5.2微孔尼龙滤膜：0.22μm。
6仪器和设备
6.1高效液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）。
6.2分析天平：感量0.00001 g和0.01 g。
6.3高速离心机：10 000r/ min。
6.4涡旋混合器。
6.5均质机。
6.6旋转蒸发仪。
6.7固相萃取装置。
6.8梨形瓶：100 mL。
6.9超声波清洗器。
6.10塑料离心管：10 mL和50 mL。
7试样的制备与保存
7.1试样的制备
按GB/T 30891-2014附录B的要求制样。
a）取均质的供试样品，作为供试试样；
b）取均质的空白样品，作为空白试样；
c）取均质的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试样。
7.2试样的保存
-18℃以下保存。
8测定步骤
8.1提取
取试料5 g（准确至±0.05 g），于50 mL离心管中，准确加入30μL混合内标工作液和乙酸-乙酸钠缓冲液10 mL，涡旋30 s，加乙酸乙酯-甲基叔丁基醚溶液10 mL，涡旋1 min，超声10 min，涡旋混合1 min，于8000r/min离心8min，取上层有机相于100mL梨形瓶；残渣用乙酸乙酯10mL重复提取1次，有机相合并至梨形瓶中，于35℃水浴旋转蒸发至干。对蒸干后有油脂残留的样品，用氮气或空气将残留在油脂中的乙酸乙酯吹除干净。加入正己烷7 mL溶解残留物，备用。
8.2净化
取C18固相萃取柱，依次用甲醇、正己烷各5 mL活化。取备用液，过柱，控制流速不超过1滴/s；用正己烷10 mL淋洗，吹干；用甲醇10 mL洗脱，收集洗脱液，于40℃水浴旋转蒸发至干。准确加入甲醇0.85 mL，涡旋混合1 min，再准确加入水0.15 mL，混合30 s，8 000 r/min，离心6 min，上清液用0.22μm尼龙滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱测定。
8.3基质匹配标准工作曲线的制备
分别取10μL、25μL、50μL、100μL、250μL、500μL混合标准工作溶液于5 mL玻璃离心管中，分别加混合内标工作液30μL，吹干，加入经7.1和7.2步骤处理所得的基质空白溶液1.0 mL，混合1 min，配制成激素浓度为2 ng/ mL~ 400 ng/mL系列基质匹配标准工作液，上机测定。以标准物质特征离子色谱峰的峰面积与内标物特征离子色谱峰的峰面积比值为纵坐标、相应的浓度为橫坐标，绘制基质标准工作曲线。求回归方程和相关系数。
8.4测定
8.4.1液相色谱参考条件
a）色谱柱：XBridge Shield RP18柱（4.6 mm×150 mm，5μm），或相当者；
b）流速：0.4 mL/min；
c）进样量：20μL；
d）柱温：25℃；
e）流动相A为甲醇；流动相B为0.02%氨水，梯度洗脱程序见表1。
8. 4.2质谱参考条件
a）离子源：ESI；
b）喷雾电压：3.0 kV；
c）离子传输管温度：350℃；
d）鞘气流速：13.3 L/ min；
e）辅助气流速：3.3 L/min；
f）碰撞气压：0.199 5 Pa；
g）检测方式：多反应监测（MRM），27种激素及内标物多反应监测母离子、子离子、碰撞能量和扫描方式见表2。
8.5测定法
8.5. 1定性测定
在同样的测试条件下，试料溶液中激素类药物的保留时间与标准工作液中激素类药物的保留时间之比偏差在±2.5%以内；且检测到的离子的相对丰度，应当与浓度相当的校正标准溶液的离子相对丰度一致。其允许偏差应符合表3的要求。
8.5.2定量测定
取试料溶液和基质匹配标准工作液，作单点或多点校准，按内标法定量。基质匹配标准工作液及试料溶液中目标物的响应值均应在仪器检测的线性范围内。在上述色谱-质谱条件下，标准溶液特征离子质量色谱图见附录B。
8.6空白试验
取空白试样，除不加药物外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。
9结果计算和表述
试样中待测药物的残留量按标准曲线或公式（1）计算。
式中：
X——试样中待测物残留量的数值，单位为微克每千克（μg/kg）；
A——试样溶液中待测物的峰面积；
Ais——试样溶液中内标的峰面积；
AS——标准溶液中待测物的峰面积；
A'is——标准溶液中内标的峰面积；
Cis——试样溶液中内标浓度的数值，单位为微克每升（μg/L）；
Cs——标准溶液中待测物浓度的数值，单位为微克每升（μg/L）；
C'is——标准溶液中内标浓度的数值，单位为微克每升（μg/L）；
V——定容体积的数值，单位为毫升（mL）；
m——供试试样质量的数值，单位为克（g）。
10方法灵敏度、准确度和精密度
10.1灵敏度
本方法己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、群勃龙、诺龙、雄烯二酮、勃地酮、睾酮、美雄酮、甲基睾酮、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、孕酮、21a-羟基孕酮、17a-羟基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲羟孕酮检测限为0.5μg/kg，定量限为1.0μg/kg；己烷雌酚、雌二醇、左炔诺孕酮、炔诺酮、苯甲酸雌二醇和康力龙的检测限为1.0μg/kg，定量限为2.0μg/kg；雌三醇和炔雌醇的检测限为2.0μg/kg，定量限为4.0μg/kg。
10.2准确度
本方法己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、群勃龙、诺龙、雄烯二酮、勃地酮、睾酮、美雄酮、甲基睾酮、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、孕酮、21a-羟基孕酮、17a-羟基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲羟孕酮在1.0μg/kg~ 20μg/kg添加浓度范围内回收率为60% ~ 120%；己烷雌酚、雌二醇、左炔诺孕酮、炔诺酮、苯甲酸雌二醇和康力龙在2.0μg/kg~40μg/kg添加浓度范围内回收率为50%~ 120%；雌三醇和炔雌醇在4.0μg/kg~80μg/kg添加浓度范围内回收率为60%~ 120%。
10.3精密度
本方法的批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤20%。
